光遺伝学の中心的なツール、チャネルロドプシンのチャネル開閉メカニズムを新開発時間分解ラマン分光系で解明！

研究成果

東京大学物性研究所の柴田桂成特任研究員（研究当時大学院生）、秋山英文教授、井上圭一准教授、同大学大学院理学系研究科の濡木理教授、西澤知宏准教授（研究当時）、小田和正博士らの研究グループは、生物の神経活動を光で操作する光遺伝学の中心的な分子ツールである、チャネルロドプシンのチャネル開閉メカニズムを解明することに成功しました。

図1　C1C2の始状態構造。緑色のらせん部分がαヘリックス、ピンク色部分がレチナール。

チャネルロドプシン(channelrhodopsin : ChR)は7本のαヘリックスと、色素分子であるレチナールから構成される膜タンパク質であり、光受容型イオンチャネルとして機能します（図1）。ChRは、光によって神経細胞の活動を制御する光遺伝学（オプトジェネティクス）の中心的なツールであり、神経科学や脳神経疾患の治療法開発に欠かせないタンパク質です。しかし、応用面での注目に反して、ChRのチャネル開閉メカニズムは不明なままでした。そのため、イオン輸送特性の改良が十分に進まず、光遺伝学の適応範囲が限られていました。

開閉メカニズムの解明には、ChRの構造情報が不可欠です。ChRの構造測定は、代表的なChRであるC1C2を対象に、X線結晶構造解析を用いて進められてきました。2012年には光吸収前における始状態構造が、2021年にはチャネル開口直前の状態おける構造が報告されています。一方、X線結晶構造解析では、結晶化に伴うタンパク質のパッキングが原因でチャネルが開かないため、最も重要なチャネル開口時や、それ以降の過程における構造は不明でした。

一方でラマン分光法は、生理的な温度の水溶液中におけるタンパク質の構造を測定できます。そこで柴田氏らは、大量発現が困難であり、室温での変性が早いC1C2のラマンスペクトルを取得すべく、5 nmolかつ90分でスペクトルを取得できる光学系を開発しました（図2）。

図2　開発された時間分解ラマン分光系の一部

そして、開発した光学系を用いてC1C2の構造を測定した結果、チャネル開口時にレチナールが大きくねじれることが明らかになりました。また、構造情報と電気生理、過渡吸収測定の結果を組み合わせることで、
①：レチナールがねじれることで周囲のヘリックスが押し出され、チャネルが開く
②：イオン輸送経路は、レチナールとタンパク質を結ぶシッフ塩基結合を通過するように形成される
③：タンパク質外から流入した水分子を経由して、プロトンがシッフ塩基へと移動する
④：シッフ塩基がプロトン化するとレチナールのねじれが緩和し、チャネルが閉じる
⑤：チャネルが閉じる速度は、シッフ塩基のプロトン化速度によって決定されている

という、C1C2の詳細なチャネル開閉メカニズムを解明することに成功しました（図3）。

図３　明らかになったチャネル開閉メカニズム。レチナールのねじれとその緩和により、チャネルが開閉し、イオン輸送経路にはシッフ塩基を通過するように形成される。また、タンパク質外から流入した水がシッフ塩基へのプロトン移動を媒介し、シッフ塩基のプロトン化速度がチャネル閉口を律速する。

今回得られた開閉メカニズムに基づけば、レチナール周辺のアミノ酸に変異を加えることでイオン輸送量を増やすことや、レチナールシッフ塩基のプロトン化速度を最適化することで、高速に開閉するChRを開発することができると期待されます。したがって、本研究成果は、光受容型イオンチャネルに関する理解を前進させたという基礎科学的な面だけでなく、次世代型の光遺伝学ツールの開発指針を与えたという応用科学的な面にも、強い意義を持ちます。

本研究成果は2023年5月2日（米国東部標準時）に米国科学誌「Journal of the American Chemical Society」に掲載されました。

発表論文

雑誌名：Journal of the American Chemical Society
論文タイトル：Twisting and Protonation of Retinal Chromophore Regulate Channel Gating of Channelrhodopsin C1C2
著者： Keisei Shibata, Kazumasa Oda, Tomohiro Nishizawa, Yuji Hazama, Ryohei Ono, Shunki Takaramoto, Reza Bagherzadeh, Hiromu Yawo, Osamu Nureki, Keiichi Inoue, and Hidefumi Akiyama
DOI：10.1021/jacs.3c01879

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